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      四種蛋白含量測定方法(雙縮脲法、BCA法、Lowry法,考馬斯亮藍法)

      發布時間: 2022-04-07  點擊次數: 1128次

       蛋白質是一切活細胞和有機體的最重要和最必需的組成成分,它是構成人體及所有動物機體組織干物質的主要部分。例如,人體按總量計算,干重54%是蛋白質,即除去水分后,蛋白質約占體重的一半左右,可見蛋白質是生命活動中最重要的物質基礎。

             蛋白質是由二十種氨基酸以肽鍵相互聯接而成的復雜的高分子化合物,它水解的最終產物是氨基酸。在蛋白質分子內又通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力構成蛋白質的空間結構,即蛋白質的構象( conformation )。當蛋白質分子受到某些物理、化學因素影響時,它的空間結構就會發生改變或破壞,物理化學性質和生物學性質也隨著發生變化,稱為蛋白質的變性作用。因此在研究蛋白質的生物學功能時,應防止它的變性作用。

             蛋白質在溶液中的分子大小,溶解度,電荷,吸附性質和對其他分子的親和力等各不相同,根據這些因素,可以選擇一定的方法分離,制備和鑒定蛋白質。利用蛋白質肽鏈末端基的特點,還可以設計特殊的分析技術來測定蛋白質的一級結構。

             氨基酸是構成蛋白質的基本單位,它也是生物體維持生長所必需的營養物質,具有特殊的生理作用,參與生物機體的代謝。因此對氨基酸的分離測定在實際工作中也是重要的。

             蛋白質含量可從它們的物理化學性質,如折射率、比重,紫外吸收、染色等測定而得知;或用化學方法,如定氮、雙縮脲反應、 folin﹣酚試劑反應、BCA法等方法來測定。其中 Folin ﹣酚試劑法考馬斯亮藍染色法是一般實驗室中經常使用的方法。而 Folin﹣酚試劑法靈敏度較高,較紫外吸收法靈敏10~20倍,而較雙縮脲法靈敏100倍左右。這類方法操作簡便、迅速,不需要復雜和昂貴的設備,又能適合一般實驗室的要求,若作一般測定較為適宜。

             一、雙縮脲法

             1.原理

              在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物,其顏色的深淺與蛋白質的含量成正比,而與蛋白質的相對分子質量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定范圍1~10mg蛋白質。

              雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的測定。硫酸銨不干擾此呈色反應,使其有利于對蛋白質純化早期步驟的測定。

              干擾此測定的物質包括在性質上是氨基酸或肽的緩沖劑,例如 Tris 緩沖液,因為它們給予陽性呈色反應。Cu2+也容易被還原,有時發現出現紅色沉淀。

             2.試劑和器材

               ①試劑

          標準酪蛋白溶液(10mg/mL):酪蛋自要預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據其純度稱量配制成標準溶液。用0.05mol/L 氫氧化鈉溶液配制。亦可用10mg/ mL 牛血清清蛋白溶液。

             雙縮脲試劑:取1.50g硫酸銅(CuSO4•5H2O)和6.0g酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O ),用500mL水溶解,在攪拌下加入300mL10%氫氧化鈉溶液,用水稀釋到1000mL,貯存于塑料瓶中(或內壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現,則需重新配制。

             ②器材

               分光光度計,恒溫水浴

             3.操作方法

              標準曲線的制定:取12只試管分成兩組,分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL的標準酪蛋白溶液,用水補足到1mL,然后各加入4mL雙縮脲試劑,充分搖勻后,在室溫下(20~25℃)放置30分鐘,于540nm處進行比色測定。取兩組測定的平均值,以酪蛋白的含量為橫坐標,光吸收值為縱坐標繪制標準曲線,作為定量的依據。

              用同樣的方法測定未知樣品,注意樣品濃度每ml不要超過10mg,否則要適當稀釋。

             二、Folin﹣酚試劑法(Lowry法)

               1.原理

               用于蛋白質測定的 Lowry 反應是雙縮脲方法的發展,第一步涉及到在堿性溶液中銅﹣蛋白質復合物的形成,然后這個復合物還原磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑(Folin氏試劑),產生深藍色(鉬藍和鎢藍混合物)。這個測定法較雙縮脲法靈敏得多。對雙縮脲反應發生干擾的離子同樣容易干擾Lowry反應,而且對后者的影響還要大得多。所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用。濃度較低的尿素(約0.5%左右)、胍(0.5%左右)、硫酸鈉(1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙SUAN(0.5%)、乙醇(5%)、乙MI(5%)、丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,這些物質濃度高時必須做校正曲線。含硫酸銨的溶液只須加濃碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色后色淺,則必須提高碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

               進行測定時,加 Folin 氏試劑要特別小心,因為 Folin 氏試劑僅在酸性pH 條件下穩定,但上述還原反應只是在pH10的情況下發生,故當Folin氏試劑加到堿性的銅﹣蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑被破壞之前,還原反應即能發生。

      此法也適用于酪氨SUAN和色氨SUAN的定量測定。

             2.操作方法

          2.1樣品測定

                 取1ml樣品溶液(約含20-250ug多肽或蛋白質),加入5ml試劑甲,混勻,于20~25℃保溫30分鐘,然后于500nm處比色。以1ml水樣替代品作為空白對照。

             2.2標準曲線的制定

                 取14只試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL標準蛋白溶液(250ug/ml),用水補足到1mL,然后按上述方法進行操作,測定光吸收值。取兩組測定的平均值,以蛋白質濃度為橫坐標,光吸收值為縱坐標,繪制標準曲線作為定量的依據。

                若用0.5cm光程的比色池進行比色,可按下面方法進行操作:取0.2ml樣品溶液(約含5~100ug多肽或蛋白質),加入1ml試劑甲(可選用0.3cm~0.5cm直徑的小試管),混勻,10分鐘后再加0.1ml試劑乙,立即搖勻,30分鐘后比色。若多肽或蛋白質濃度在5~25ug,則波長用755nm,25ug以上則采用500nm比色為宜。

             3.試劑和器材

                3.1試劑

      1. 標準蛋白質溶液:可用結晶牛血清清蛋白或酪蛋白,預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據其純度配制成250ug/ml的溶液。

      2. Folin-酚試劑的配制(均用分析純試劑):

          試劑甲:由下述4種溶液配制的。(1)4%碳酸鈉( Na2CO3)溶液;(2)0.2mol/L 氫氧化鈉溶液;(3)1%硫酸銅( CuSO4•5H2O )溶液;(4)2%酒石酸鉀鈉溶液(或酒石酸鉀、酒石酸鈉)。在使用前,將(1)與(2)等體積混合配成碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液,將(3)與(4)等體積混合配成硫酸銅﹣酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩種溶液按50:1的比例混合,即為 Folin﹣酚試劑甲。該試劑只能用一天,過期失效。

                試劑乙( Folin 氏試劑):市售福林酚試劑

             3.2器材

                分光光度計    恒溫水浴

             三、考馬斯亮藍染色法(Bradford法)

               1.原理

                1976年 Bradford 建立了用考馬斯亮藍 G -250與蛋白質結合的原理,迅速、敏感的定量測定蛋白質的方法。染料與蛋白質結合后引起染料最大吸收的改變,從465nm變為595nm,光吸收增加。蛋白質﹣染料復合物具有高的消光系數,因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度,檢出量為1ug蛋白。染料與蛋白質的結合是很迅速的過程,大約只需2分鐘,結合物的顏色在1小時內是穩定的。一些陽離子,如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4,乙醇等物質不干擾測定,而大量的去污劑如 TritonX -100, SDS 等嚴重干擾測定,少量的去污劑可通過用適當的對照而消除。以下試劑對考馬斯亮藍 G -250-蛋白質復合物有影響:1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由于染色法簡單迅速,靈敏度高,現已廣泛應用于蛋白質含量的測定。

             2.操作方法

          2.1標準方法

           取含10~100ug蛋白質溶液于小試管中,用雙蒸水或緩沖液調體積到0.1mL ,然后加入5mL蛋白試劑,充分振蕩混合,2分鐘后于595nm測定光吸收值。以0.1mL 雙蒸水或緩沖液及5mL 蛋白試劑作為空白對照。

             2.2微量蛋白分析法

           取含1~10ug蛋白質溶液,用雙蒸水調體積到0.8mL,加0.2mL蛋白試劑,充分振蕩混合,2分鐘后于595nm測定光吸收值,以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為空白對照。

           用不同濃度的蛋白質溶液作標準曲線,以蛋白濃度為橫坐標,光吸收值為縱坐標,繪制標準曲線作為定量的依據。

             3.試劑和器材

          試劑

      1. 標準蛋白質溶液:可用牛血清清蛋白預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,根據其純度配制成1mg/ mL 的溶液?;蚋鶕Q迩宓鞍椎淖贤庀庀禂?A1% 1cm=6.6來確定。

      2. 蛋白試劑的配制:稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml95%乙醇,加入100ml85%(W/V)磷酸,將溶液用水稀釋到1000ml。試劑的終濃度為0101%考馬斯亮藍G-250,4.7%(W/V)乙醇,和8.5%(W/V)磷酸。

         器材

               分光光度計     微量注射器

             四、BCA法

                1.產品描述

                   BCA(Bicinchonininc Acid)蛋白含量檢測法是用于總蛋白質定量的常用方法,BCA 與二價銅離 子混合即為 BCA 工作液,蛋白在堿性條件下能夠將 Cu2+還原為 Cu+,Cu+與 BCA 試劑可形成紫色絡 合物,產物在 562 nm 處具有特征吸收峰,通過吸光值變化即可定量檢測樣品的蛋白濃度。

                2.注意事項

                  ①Copper Solution 與 PBS Diluent 可置于 2-8℃長期保存,若發現污染渾濁則應丟棄;BCA Solution 在低溫條件下出現結晶沉淀時,可 37℃溫育使其完全溶解,不影響使用;

                  ②為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作;

                  ③BCA 法測定蛋白含量不受絕大部分樣品中化學物質的影響,樣品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用濃度去垢劑不影響檢測結果,但 EDTA 和 EGTA 等螯合劑、DTT 和巰基 乙醇等還原劑和脂類會影響檢測結果,需確保 EDTA 低于 10 mM、無 EGTA、二硫蘇糖醇低于 1 mM、 巰基乙醇低于 0.01%;若樣品含有較多干擾物質且本身背景值較高,建議使用 Bradford 法蛋白含量檢測試劑盒(Cat AKPR015);

                  ④若蛋白濃度較低時(小于 50 μg/mL),可將顯色溫度提高至 60℃且待測樣本

      與工作液比例調整 為 1:8 進行測定,能夠明顯提高靈敏度至 5 μg/mL;

                  ⑤為保證結果準確且避免試劑損失,測定前請仔細閱讀說明書(以實際收到說明書內容為準), 確認試劑儲存和準備是否充分,操作步驟是否清楚,且務必取 2-3個預期差異較大的樣本進行預測定,過程中問題請您及時與工作人員聯系。


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