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        核黃素(維生素B2)熒光光度定量測定法

        發布時間: 2022-04-07  點擊次數: 222次

         一、目的

               1.了解熒光法測定核黃素的原理和方法

               2.學習熒光光度計的操作和使用

               3.掌握熒光定量分析工作曲線

        二、原理

               核黃素(維生素B2)是一種異咯嗪衍生物,其水及乙醇的中性溶液為黃色,并且有很強的熒光,這種熒光在強酸和強堿中易被破壞。核黃素可被亞硫酸鹽還原成無色的二氫化物,同時失去熒光,因而樣品的熒光背景可以被測定。二氫化物在空氣中易重新氧化,恢復其熒光,

        三、實驗器材

               1.核黃素片(5mg/片)

               2.熒光光度計

               3.容量瓶100ml(*2)

               4.試管1.5cm*15cm(*7)

               5.吸管10.0ml(*1),5.0ml(*1),2.0ml(*1),0.50ml(*2)

               6.量筒1000ml(*1),100ml(*1)

        四、實驗試劑

               1.核黃素標準溶液:準確稱取核黃素10mg,放入預先裝有約50ml蒸餾水的1000ml容量瓶中,加入 5ml 6mol/ L 乙酸,再加入大約800ml水,置水浴中避光加熱直至溶解,冷卻至室溫,用蒸餾水定容至1000ml,混勻。

               2.連二亞硫酸鈉(保險粉)或亞硫酸鈉。

               3.  36%乙酸。

        五、操作

            1.標準曲線繪制

               將配好的10ug/ ml 標準核黃素溶液,按表50所示比例稀釋成六個標準溶液。

            2.樣品溶液的配制

               將被測的樣品(如核黃素藥片、維生素 B 針劑等)參照標準溶液的含量范圍和溶劑體系配制成測定溶液。對于食物和生物材料中的核黃素測定,一定需要事先經過抽提,或經過分離,純化處理。

            3.熒光測定

               參照附錄六中熒光光度計的使用說明,選用濾色片,核黃素熒光測定的激發光波長為460nm,發射光波長為520nm。因此可選用帶迪型400nm(藍色)濾色片為激發光濾色片,選用截止型510nm(紅色)濾色片為發射光濾色片。待儀器預熱并調好零點后,用0號標準溶液(2.5ug/ ml )作為參比溶液調熒光光度計的熒光強度讀數到滿刻度(100%),分別測定其他標準溶液和樣品溶液的相對熒光強度,在測定中如果樣品溶液的熒光強度超出100%則需要再行稀釋,在每一個測定溶液測定完后,需要重新倒回到相應的試管內。

            4,  數據處理

               每一個測定溶液的熒光強度讀數矯正公式為:F=F1+F2

               式中 F:校正后的熒光強度;

                       F1:未還原時測得的熒光強度:

                       F2:還原后測得的熒光強度。

               以標準溶液校正后的熒光強度為縱坐標,相應的含量為橫坐標,作出核黃素測定的標準曲線。將樣品溶液校正后的熒光強度在工作曲線上查出相應的含量。

        六、注意事項

               在所有操作過程中,要避免核黃素受陽光直接照射。


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